全外显子测序 （Whole-exome sequencing，WES）是高频应用基因组测序方法。外显子是人基因组的蛋白编码区域，利用序列捕获技术可以将其DNA捕获并且富集。虽然外显子区域仅占全基因组1%左右[1]，却包含了85%的致病突变[2]。相比全基因组测序，全外显子测序更加经济、高效。外显子组测序主要用于识别和研究与疾病、种群进化相关的编码区及UTR区域内的变异。结合大量的公共数据库提供的外显子数据，有利于更好地解释所得变异与疾病的关系。
技术优势
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直接对蛋白编码序列进行测序，找出影响蛋白结构的变异
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高深度测序，可发现变异频率低于1%的罕见变异
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仅针对外显子组区域，有效降低测序费用、存储空间和工作量
产品应用
相比于全基因组测序，外显子区域占比小（约1%），因此更容易做到更高深度测序，检测到更多低频和罕见变异，同时也能降低测序费用和存储空间。外显子测序，50M的捕获区域，测序数据量10-12Gb就可以得到100X的有效测序深度。这个特性决定了外显子测序在遗传性疾病和肿瘤研究中的重要作用，特别是做肿瘤异质性研究。由于肿瘤异质性，肿瘤内部有很多亚克隆，有些亚克隆的占比很低，应用外显子高深度测序可以更快、更经济地检测出普通测序深度难以发现的体细胞突变。
图1 外显子测序产品应用
华大基因采用Agilent等液相捕获系统，对人的全外显子组区域的DNA进行高效捕获富集，然后提供基于DNBSEQTM测序技术的捕获测序服务。建库和杂交实验采用官方指定试剂盒，严格使用说明书推荐的试剂和耗材，并参照经过优化的实验流程进行操作。如下为DNBSEQTM外显子测序技术流程。
图2 DNBSEQTM平台外显子建库流程
测序原理
DNBSEQTM平台外显子测序产品 ，采用先进的联合探针锚定聚合技术（cPAS）和改进的DNA纳米球（DNB）核心测序技术，提供一站式、开放性的基因测序全面解决方案，具备精准、简易、快速、灵活、可拓展等优点，既能充分适用临床检测，也能满足更广泛的科研需求。该测序平台产品的外显子数据均一性好、单个碱基质量值高。该平台有五大关键的技术：DNB、Pattern array、cPAS、MDA-PE、sCMOS，保证了该平台测序的准确性。
图3 DNBSEQTM平台优势
首先，单链环状 DNA 分子通过滚环复制，线性扩增2-3个数量级，增强信号。所产生的扩增产物称为DNA纳米球（DNA nanoball, DNB），采用高密度DNA纳米芯片技术，将得到的DNBs加到芯片上的网状小孔内（固定在阵列化的硅芯片上）。通过联合探针锚定聚合技术（cPAS）和多重置换扩增的双末端测序法（MDA-PE）得到读长为100bp/150bp的双末端序列。
图4 DNA 纳米球示意图
MDA-PE的具体原理是：完成第一链（Forward Strand）测序后，在具备链置换功能的高保真聚合酶的作用下，合成第二链（Reverse Strand），并通过DNA分子锚，进行第二链的测序。MDA-PE法具有合成快、准确度高等优点。与其他二代测序技术相比较，DNB测序技术具有以下几个优势：
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DNB通过增加待测DNA的拷贝数而增强了信号强度，从而提高测序准确度。
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不同于PCR指数扩增，滚环扩增技术的扩增错误不会累积。
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DNB与芯片上的网状小孔大小相同，每个小孔只固定一个DNB，保证信号点之间不产生相互干扰。
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阵列化测序芯片和DNB测序技术的结合，使得成像系统像素和测序芯片的面积得到充分利用。
信息分析
信息分析从测序的下机数据（raw data）开始，原始下机数据过滤掉接头、低质量碱基、未测出的碱基（以 N 表示）后比对到参考基因组上，进行SNP检测和InDel或者CNV分析，然后通过数据库注释，对变异检测的结果通过基于变异有害性、样本情况和基因功能表型三种分析策略，筛选出于疾病相关的有害性位点或基因。另外, 为了保证高质量的测序数据，在整个分析流程中设置了严格的数据质控体系（QC）。
图5 疾病信息分析内容
外显子测序主要适用于肿瘤易感性、致病机理、癌症异质性、转移和复发以及药物疗效研究。其中癌症异质性需要高深度测序，建议200X以上有效深度，FFPE样品建议200-300X对应的数据量，需要尽量全面、准确地检测肿瘤组织发生的所有突变信息，所以测序深度需要尽可能高，以检测低丰度突变位点。ctDNA建议500X及以上有效测序深度，用于检测Somatic 突变以及频率来判断ctDNA的存在和水平，从而反应肿瘤负荷等信息。
图6 肿瘤信息分析内容
产品优势
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捕获平台：Agilent v6芯片和IDT等多种探针选择
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测序平台：单链滚环复制，更少PCR扩增错误引入
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质量卓越：DNBSEQ的变异检测一致性高，对InDel检测灵敏度更高，更适合高深度的肿瘤研究
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项目经验：发表国内第一篇外显子测序文章，项目经验10年＋，平台稳定
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广泛合作：大学、医院、科研院所、制药公司合作超过6000次，样品总数16万+
参考文献
1. Ng SB1, Turner EH., et al. Targeted capture and massively parallel sequencing of 12 human exomes. Nature.461(7261):272-6.
2. Choi M1,Scholl UI., et al. Genetic diagnosis by whole exome capture and massively parallel DNA sequencing.Proc Natl Acad Sci USA. 106(45):19096-101.
